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核酸鑒定方法之濃度

閱讀：27發(fā)布時(shí)間：2025-4-24

      核酸純化在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)廣泛應(yīng)用。怎樣獲得質(zhì)量、純度的DNA或RNA樣品對(duì)下游實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行至關(guān)重要，因此，對(duì)純化后的核酸進(jìn)行鑒定也是的步驟。本文簡(jiǎn)單的回顧學(xué)習(xí)下核酸鑒定的方法。
核酸鑒定包括：濃度/純度鑒定+完整性鑒定
 
1.濃度/純度鑒定
 
（1）紫外分光光度計(jì)：
原理：由于核酸中的堿基都具有共軛雙鍵，所以具有紫外光吸收性質(zhì)。核酸在紫外光譜區(qū)有條典型的吸收曲線，其吸收峰在260nm處，吸收低谷在230nm處。蛋白質(zhì)在紫外區(qū)的吸收峰在280nm處，所以核酸的紫外吸收光譜數(shù)據(jù)是鑒定核酸的重要依據(jù)之。

由于核苷酸大吸收波長(zhǎng)為260nm,根據(jù)朗伯-比爾定律可計(jì)算出在波長(zhǎng)260nm的紫外線下，1個(gè)OD值的光密度大約相當(dāng)于50µg/ml的雙鏈DNA， 40µg/ml的單鏈RNA。紫外分光光度法只適用于測(cè)定濃度大于0.25µg/ml的核酸溶液。
 
計(jì)算公式:
dsDNA（µg/µl）=OD260x50x稀釋倍數(shù)/1000
RNA（µg/µl）=OD260x40x稀釋倍數(shù)/1000
 
純凈的DNA OD260/OD280=1.8，制備的樣品DNA比值在1.7-1.9，若洗脫時(shí)不使用洗脫緩沖液而使用去離子水，比值會(huì)偏低，因?yàn)镻H值和離子存在會(huì)影響光的吸收值。

當(dāng)OD260/OD280< 1.7，表明蛋白質(zhì)含量較，可用利用酚、氯仿、異戊醇抽提，再用乙醇沉淀去除。
當(dāng)OD260/OD280> 2.0，表明RNA含量較。可用RNaseA消化后再進(jìn)行純化。
OD260/OD230的值，般不小于2.0，若小于2.0，表明有碳水化合物、鹽類或有機(jī)試劑污染。

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