液相色譜儀原理_液相色譜儀能測什么?HPLC操作步驟[專題]

本文主題詞：液相色譜儀,液相色譜儀原理,液相色譜儀能干什么,高效液相色譜儀操作步驟

一、高效液相色譜儀原理：

高效液相色譜法的原理是在原始的經典色譜法基礎上面引用氣象色譜的理論，把原來的流動性改變為壓力可達到4.9′107Pa。色譜柱則是用特殊的方式用小顆粒裝填而成。造成的結果就是色譜柱的柱效遠遠高于原始的經典液相色譜。并且它柱子使用后還能具有高度靈敏度檢測器。能夠對流出來的分析物進行連續檢測。

通俗來講就是：

多年前大學老師講的，至今認為是最形象的對“色譜”的描述—講一群女孩子去逛街，街上店鋪林立，但是每個女孩子都有自己不同的喜好于是有的進了這家，有的進了那家，最后大家越走越分散，所以有的先走出這條街，有的后走出來—女孩子指化合物，這條街是色譜柱。店鋪是固定相，推著化合物走得是流動相，提供動力的是泵，最后站在街尾數人數認人的是檢測器。認人帶著照片啥的是標準品，認出來走到倒數第二個的女孩就是你朝思暮想的那位。就可以定義或定量分析了。這就是高效液相色譜儀的原理

二、高效液相色譜儀能測什么？

高效液相色譜儀是利用混合物各組分在固定相和流動相中溶解、分配或吸附等化學作用性能的差異，使各組分在作相對運動的兩相中反復多次受到上述各作用力而達到相互分離。高效液相色譜儀在食品分析、環境分析、生命科學、醫學檢驗和無機分析等領域得到廣泛使用。一般來說，80%～85% 的有機物原則上可采用高效液相色譜儀分析。

一、在食品分析中的應用：

1、食品營養成分分析：

蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸和蘋果酸等）、有機胺和礦物質等分析。

2、食品添加劑分析：

甜味劑、防腐劑、著色劑（檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃和亮藍等）和抗氧化劑等分析。

3、食品污染物分析：霉菌毒素（、黃桿菌毒素和大腸桿菌毒素等）、微量元素和多環芳烴等分析。

二、在環境分析中的應用：

多環芳烴（特別是稠環芳烴）和農藥殘留（氨基甲酸脂類，反相色譜）等分析。

三、在生命科學中的應用：

1、低分子量物質：氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類和維生素等分析。

2、高分子量物質：多肽、核糖核酸、酶（胰島素、激素、細胞色素和干擾素等）和蛋白質等分析。

四、在醫學檢驗中的應用：1、合成藥物：抗生素、抗憂郁藥物和黃胺類藥等分析。2、天然藥物生物堿：吲哚堿、顛茄堿和強心甙等分析。五、在無機分析中的應用：陽、陰離子等分析。這就是高效液相色譜儀能測什么？

三、高效液相色譜儀操作步驟：

1、開機設定參數（檢測波長、流速），更換所需流動相，檢查色譜柱是否正確。

2、排液置換管路中流動相，沖洗進樣閥，洗好進樣針。

3、沖洗色譜柱進行平衡，其間可提前進行樣品的處理，樣品信息的注冊。

4、平衡好以后進空白試驗，排除系統污染。

5、柱子穩定好以后進樣，等待運行結束（其間清洗進樣針），積分計算，出具報告。

詳細操作步驟如下：

1、 開機操作：

（1）、打開電源，用Harb相連接時，注意Harb電源，打開計算機，打開Bootp Server（一般啟動時已打開）；

（2）、自上而下打開個組件電源，Bootp Server里顯示有信號時（有六行字符），打開工作站（先打開On line）；

（3）、打開沖洗泵頭的10％異丙醇溶液的開關（需用針捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量為準；

（4）、注意各流動相所剩溶液的容積設定，若設定的容積低于限會自動停泵，注意洗泵溶液的體積，及時加液；

（5）、使用過程中要經常觀察儀器工作狀態，及時正確處理各種突發事件。

2、 先以所用流動相沖洗系統一定時間（如所用流動相為含鹽流動相，必須先用水沖洗20分鐘以上再換上含鹽流動相），正式進樣分析前30min 左右開啟D燈或W燈，以延長燈的使用壽命；

3、 建立色譜操作方法，注意保存為自己命名的Method，勿覆蓋或刪除他人的方法及實驗結果；

4、 使用手動進樣器進樣時，在進樣前和進樣后都需用洗針液洗凈進樣針筒，洗針液一般選擇與樣品液一致的溶劑，進樣前必須用樣品液清洗進樣針筒3遍以上，并排除針筒中的氣泡；

5、 溶劑瓶中的沙芯過濾頭容易破碎，在更換流動相時注意保護，當發現過濾頭變臟或長菌時，不可用超聲洗滌，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗滌；

6、 實驗結束后，一般先用水或低濃度甲醇水溶液沖洗整個管路30分鐘以上，再用甲醇沖洗。沖洗過程中關閉D燈、W燈；

7、 關機時，先關閉泵、檢測器等，再關閉工作站，然后關機，最后自下而上關閉色譜儀各組件，關閉洗泵溶液的開關；

8、 使用者須認真履行儀器使用登記制度，不要擅自拆卸儀器。

流動相：

1、 流動相應選用色譜純試劑、高純水或雙蒸水，酸堿液及緩沖液需經過濾后使用，過濾時注意區分水系膜和油系膜的使用范圍；

2、 水相流動相需經常更換（一般不超過2天），防止長菌變質；

3、 使用雙泵時，A、B、C、D四相中，若所用流動相中有含鹽流動相，則A、D（進液口位于混合器下方）放置含鹽流動相，B、C（進液口位于混合器上方）放置不含鹽流動相；

A、B、C、D四個儲液器中其中一個為棕色瓶，用于存放水相流動相。

樣品：

1、 采用過濾或離心方法處理樣品，確保樣品中不含固體顆粒；

2、 用流動相或比流動相弱（若為反相柱，則極性比流動相大；若為正相柱，則極性比流動相小）的溶劑制備樣品溶液，盡量用流動相制備樣品液；

手動進樣時，進樣量盡量小，使用定量管定量時，進樣體積應為定量管的3～5倍；

色譜柱：

1、 使用前仔細閱讀色譜柱附帶的說明書，注意適用范圍，如pH值范圍、流動相類型等；

2、 使用符合要求的流動相；

3、 使用保護柱；

4、 如所用流動相為含鹽流動相，反相色譜柱使用后，先用水或低濃度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇沖洗。

5、 色譜柱在不使用時，應用甲醇沖洗，取下后緊密封閉兩端保存；

6、 不要高壓沖洗柱子；

7、 不要在高溫下長時間使用硅膠鍵合相色譜柱；

4、高效液相色譜儀注意事項：

1）流動相均需色譜純度，水用20M的去離子水。脫氣后的流動相要小心振動盡量不引起氣泡。

2）柱子是非常脆弱的，*次做的方法，先不要讓液體過柱子。

3）所有過柱子的液體均需嚴格地過濾。

4）壓力不能太大，不要超過2000psi

1.使用“保護柱”，能夠延長色譜柱的使用壽命。簡單的說，“保護柱”即是很短的色譜柱，填裝和所使用液相色譜柱相同的填料。正確使用裝在液相色譜柱前面的“保護柱”，可以阻攔一些容易損壞液相色譜柱的物質。而達到延長柱子壽命的效果。如果使用“保護柱”不當會造成反效果。因為都在保護柱使用過程中。如污染達到一定程度而沒有及時更換，累積的雜物很可能會沖入色譜柱中，反而會造成色譜柱損壞。因此。使用“保護柱”時，zui重要的是要知道什么時候該保護柱。該換的時候就必須要立即更換。

2.選擇高品質的柱子，并注意使用方法；可以延長柱子的使用壽命。一般認為同一廠牌、同一型號的柱子之間的品質都相同，對品質管理很嚴格的廠家而言，這種說法是成立的。但如果廠家質管理不夠嚴格，即使是同一批號的新柱子之間的品質也有差異。所以，選用柱子時必須選擇管理嚴格的高品質柱子，我們知道，任何柱子使用過后都會產生變化。尤其如在強酸或強堿條件下使用，柱子更易產生變化。因此，盡量選用pH適用范圍大的柱子。在開發信分析方法時，許多專家建議不要使用舊柱子。因柱子一經使用。柱性會改變；如此一來，使用舊柱子開發出來的新分析方法，很可能在使用同廠牌的新柱子分析時。發生無法達到預定效果的情況。總的說。開發新分析方法時使用品質好的新主子；并且一直柱子應該使用在一種分析方法上；則柱子壽命可以延長。

3.定期沖洗柱子可以延長柱子使用壽命。我們知道柱子使用一段時間后總會有一些雜質累積在柱內。這些雜質不會隨著流動相出來，自然會逐漸影響柱子的品質。這些雜質在后來的分析譜圖上出現。而造成出現怪峰、基線不平等現象。簡單的解決方法是用較強的流動相沖洗。是在每次分析某一產品完成后沖洗。如果分析時使用緩沖劑時，用水來取代緩沖劑。先使用有機和水的混合溶液為流動沖洗緩沖劑。接著再用99%有機溶劑沖洗。如果不先用有機和水的混合溶液沖洗，而直接用99%有機溶劑沖洗的話，緩沖劑很可能會沉淀出來，而損壞柱子的品質。使用10-20倍柱體積的量來沖洗基本就足夠了。專家建議將99%有機溶劑沖洗的條件加在分析實驗程序完畢的zui后，如此一來每天在開機前都會用99%有機溶劑沖洗。一般硅膠柱可以反沖洗處理，即是在將沖洗前將柱子倒反接后再沖洗。打算使用反沖洗處理前，先參考柱子的保養說明書。所以要真正保護柱子，使用柱子的壽命延長，是使用“保護柱”和定期沖洗柱子。

五、高效液相色譜儀于超高效液相色譜儀區別：

高效液相是兩種或四種流動相在泵前進行混合，通過比例閥，比例閥是通過時間來控制比例的，容易產生氣泡，所以一般都加脫氣包或脫氣機，例如waters的ACQUITY系列產品，安捷倫的1200,1260，而超高液相兩種或四種流動相直接通過高壓泵控制比例在泵后混合，可以不需要脫氣包或脫氣機，因為壓力很高，混合時也不產生氣泡，同樣的超高液相使用的色譜柱粒徑更小，高效液相色譜一般使用色譜柱填料粒徑在5μm，3.2μm，很少使用1.7μm的色譜柱，而超高液相可以使用1.7μm內徑的填料色譜柱，色譜柱長也可以增加到250mm，減少分離時間，使分析時間大大的降低。

六、高效液相色譜儀組成和分類：

高效液相色譜儀的組成及分類
1. 高壓輸液系統
貯液裝置、高壓、過濾器、脫氣裝置等
1.1. 貯液器：貯液器用于存放溶劑。溶劑必須很純，貯液器材料要耐腐蝕，對溶劑呈惰性。貯液器應配有溶劑過濾器，以防止活動相中的顆粒進進泵內。溶劑過濾器一般用耐腐蝕的鎳合金制成，空隙大小一般為2mm。
1.2. 脫氣裝置：脫氣的目的是為了防止活動相從高壓柱內流出時，開釋出氣泡進進檢測器而使噪聲劇增，甚至不能正常檢測。
1.3. 高壓 高壓是高效液相色譜儀的重要部件，是驅動溶劑和樣品通過色譜柱和檢測系統的高壓源，其性能好壞直接影響分析結果的可靠性。
對高壓泵的基本要求是：
①流量穩定；②輸出壓力高，zui高輸出壓力為50Mpa；③流量范圍寬，可在0.01～10ml／min范圍任選。④耐酸、堿、緩沖液腐蝕。⑤壓力波動小。
1.2. 梯度洗脫裝置 梯度洗脫是利用兩種或兩種以上的溶劑，按照一定時間程序連續或階段地改變配比濃度，以達到改變活動相極性、離子強度或pH值，從而進步洗脫能力，改善分離的一種有效方法。當一個樣品混合物的容量因子是范圍很寬，用等度洗脫時間太長，且后出的峰形扁平不便檢測時，用梯度洗脫可以改善峰形、并縮短分離時間。HPLC的梯度洗脫與GC的程序升溫相似，可以縮短分析時間，進步分離效果。使所有的峰都處于分離狀態，而且峰形尖而窄。
2 進樣器
進樣器一般要求密封性好，死體積小，重復性好，保證中心進樣，進樣時對色譜系統的壓力和流量波動小，并便于實現自動化。
高壓進樣閥是目前廣泛采用的一種方式。閥的種類很多，有六通閥、四通閥，雙路閥等。以六通進樣閥zui為常用。
3.分離系統
色譜分離系統包括色譜柱、固定相和活動相。色譜柱是其核心部分，柱應具備耐高壓、耐腐蝕、抗氧化、密封不漏液和柱內死體積小、柱效高、柱容量大、分析速度快、柱壽命長的要求。通常采用優質不銹鋼管制成。
色譜柱按內徑不同可分為常規柱、快速柱和微量柱三類。
常規分析柱柱長一般為10~25cm，內徑4 ~ 5mm，固定相顆粒直徑為 5 ~ 10 mm。為了保護分析柱不受污染，一般在分析柱前加一短柱，約數厘米長，稱為保護柱。
（微量分析柱內徑小于l mm，凝膠色譜往內徑3～12 mm，制備往內徑較大，可達25 mm以上。）
4 檢測系統
檢測器的作用是將柱流出物中樣品組成和含量的變化轉化為可供檢測的信號，常用檢測器有紫外吸收、熒光、示差折光、化學發光等。
4. 1. 紫外可見吸收檢測器（ultraviolet－visible detector，UVD）
紫外可見吸收檢測器（UVD）是HPLC中應用zui廣泛的檢測器之一，幾乎所有的液相色譜儀都配有這種檢測器。其特點是靈敏度較高，線性范圍寬，噪聲低，適用于梯度洗脫，對強吸收物質檢測限可達1ng，檢測后不破壞樣品，可用于制備，并能與任何檢測器串聯使用。紫外可見檢測器的工作原理與結構同一般分光光度計相似，實際上就是裝有活動地的紫外可見光度計。
（1）紫外吸收檢測器：
紫外吸收檢測器常用氘燈作光源，氘燈則發射出紫外-可見區范圍的連續波長，并安裝一個光柵型單色器，其波長選擇范圍寬（190nm～800nm）。它有兩個流通池，一個作參比，一個作丈量用，光源發出的紫外光照射到流通池上，若兩流通池都通過純的均勻溶劑，則它們在紫外波長下幾乎無吸收，光電管上接受到的輻射強度相等，無信號輸出。當組分進進丈量池時，吸收一定的紫外光，使兩光電管接受到的輻射強度不等，這時有信號輸出，輸出信號大小與組分濃度有關。
局限：活動相的選擇受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶劑不能做 活動相，每種溶劑都有截止波長，當小于該截止波長的紫外光通過溶劑時，溶劑的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收檢測器的工作波長不能小于溶劑的截止波長
（2）光電二極管陣列檢測器（photodiode array detector， PDAD）：
也稱快速掃描紫外可見分光檢測器，是一種新型的光吸收式檢測器。它采用光電二極管陣列作為檢測元件，構成多通道并行工作，同時檢測由光柵分光，再進射到陣列式接收器上的全部波長的光信號，然后對二極管陣列快速掃描采集數據，得到吸收值(A)是保存時間(tR)和波長(l)函數的三維色譜光譜圖。由此可及時觀察與每一組分的色譜圖相應的光譜數據，從而迅速決定具有選擇性和靈敏度的波長。

七、高效液相色譜儀價格：

液相色譜儀價格：

1290 Infinity II 液相色譜儀

參考成交價格： 11.2萬元[美元]

安捷倫, 效率優先，分析效率、儀器效率、實驗室運營效率

ACQUITY Arc UHPLC超高效液相色譜儀

參考成交價格： 8.98萬元[美元]

沃特世, 四元溶劑管理UHPLC，HPLC和UHPLC方法切換簡單，幫助用戶從HPLC過渡到UPLC

Vanquish flex UHPLC超高效液相色譜儀

參考成交價格： 8萬元[美元]

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參考成交價格： 11.52萬元[美元]

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iChrom5100系列高效液相色譜儀

參考成交價格： 15~25萬元[人民幣]

依利特, 高集成度的ARM微控制器及SPI、I2C總線技術，靈活實現LAN及RS485通訊方式

LC-100plus 二元高壓高效液相色譜儀

參考成交價格： 7.65~10.85萬元[人民幣]

8、高效液相色譜儀圖片如上所示。